Лазерные конфокальные микроскопы A1MP+/A1R MP+ обеспечивают быстрое и четкое получение изображений глубоких слоев ткани живых организмов, расширяя тем самым границы традиционных исследовательских методов применяемых в биологии.
Скорость получения изображений до 420 кадров/сек (512х32 пикселей) вместе с мультифотонным формированием изображений с использованием высокоэффективной оптики и резонансного сканера A1R MP+.
Получение изображений глубоких слоев ткани образца при помощи детекторов NDD, размещенных рядом с задней апертурой объектива. Сверхчувствительные арсенид-фосфид галлиевые (GaAsP) NDD-детекторы позволяют получить изображений мозга мыши in vivo на глубине свыше 1,4 мм.
Функция автоматической юстировки лазера предусматривает быструю корректировку смещения инфракрасного лазерного луча после изменения длины волны многофотонного возбуждения.
Инфракрасный лазер подключается к микроскопу при помощи компактного оптического блока, содержащего акустооптический модулятор и выполняющего функции автоматической юстировкой лазера.
Совместимость с прямым и инвертированным микроскопами.
Обеспечивает получение оптимальных мультифотонных изображений при исследованиях мозга, других нейробиологических применений и получение in vivo изображений живых организмов.
Качество изображения
Эффективность флуоресценции увеличена на 30%, также увеличено отношение сигнал/шум. В серии микроскопов А1 MP+ технология малого угла падения лучей применена впервые на дихроичных зеркалах, благодаря чему увеличен уровень флуоресценции на 30 %. Вместо квадратного точечного отверстия с плавным изменением размера впервые используется точечная диафрагма шестигранной формы. Благодаря этому при сохранении конфокальности достигается более высокая яркость, почти эквивалентная идеально круглому точечному отверстию (на 30%больше света!).
Для увеличения эффективности и предотвращения потери сигнала при обработке пиксельных данных системой оцифровки сигнала и при сбросе, в схеме процесса обработки изображений была реализована оригинальная разработка компании Nikon – технология двойной интегрированной обработки сигнала (DISP). Сигнал отслеживается в течение всего времени приема информации с пикселя, благодаря чему достигается чрезвычайно высокое соотношение сигнал/шум. Два интегратора работают параллельно во время считывания оптической информации, что позволяет избежать пропусков.
Принцип мультифотонного возбуждения
Когда одна флуоресцентная молекула поглощает одновременно два фотона (двухфотонное возбуждение), эффективность возбуждения пропорциональна квадрату интенсивности возбуждающего излучения.
Чтобы добиться мультифотонного возбуждения, используется импульсное излучение с высокой плотностью фотонов или интенсивности. Так как лазерное излучение представляет собой очень короткие (фемтосекунды) импульсы и достигает фокальной точки после прохождения через объектив, вероятность одновременного поглощения двух фотонов становится достаточно высокой.
В случае двухфотонного возбуждения эффективность возбуждения снижается обратно пропорционально четвертой степени расстояния от фокальной плоскости. В результате только флуоресцентные молекулы расположенные в пределах объема ограниченного дифракционным пределом объектива возбуждаются и могут флуоресцировать. Этот принцип позволяет использовать NDD детекторы где для достижения конфокальных результатов не требуется точечная диафрагма.
При прохождении через образец инфракрасное излучение поглощается и рассеивается меньше, чем видимые длины волн, поэтому возбуждающее излучение может легче проникать в глубокие слои ткани.
Так как двухфотонное возбуждение сильно ограничено дифракционным пределом фокального объема, исключается необходимость использования конфокальной точечной диафрагмы для устранения попадания флуоресцентного излучения из плоскостей вне фокуса на детектор. Таким образом, обеспечивается минимизация фотоповреждений образцов и создаются условия для регистрации флуоресцентного излучения от живых образцов. При использовании NDD детектора и системы предварительной компенсации дисперсии групповых скоростей, встроенной в мультифотонный лазер, можно получать флуоресцентные изображения более глубоких слоев ткани образцов, используя стандартный конфокальный метод.
Фемтосекундные импульсные лазеры
Когда импульсное излучение, длительностью около 100 фемтосекунд, проходит через оптику микроскопа (например, объектив), длительность импульса увеличивается из-за дисперсии групповых скоростей (изменение скорости при прохождении через стеклянную подложку), вызывая снижение пиковой мощности.
Чтобы предотвратить снижение пиковой мощности импульса, в фемтосекундных импульсных лазерах для мультифотонной микроскопии компании Nikon предусмотрены механизмы предварительной компенсации дисперсии групповых скоростей, которые восстанавливают исходную длительность импульса в образце. Механизмы предварительной компенсации были оптимизированы для оптической системы Nikon. Это позволяет получать яркие флуоресцентные изображения глубоких слоев ткани образцов при минимальной мощности лазера.
Конфокальный микроскоп A1 MP+ компании Nikon позволяет получать спектральные изображения на высоких скоростях за одно сканирование. Кроме того, предусмотрены расширенные функции, включая спектральное разделение в режиме реального времени.
Разрешение по длинам волн может изменяться с помощью трех разных дифракционных решеток (2,5/6/10 нм). Каждое положение точно контролируется для достижения максимальной воспроизводимости длины волны.
Используется точно скорректированный 32-х канальный линейный детектор. Подвижный механизм тройного экранирования позволяет использовать до четырех лазеров одновременно.
Система увеличения эффективности дифракции (DEES)
При помощи системы DEES, неполяризованный флуоресцентный свет, излучаемый образцом, разделяется при помощи делителя поляризованных лучей на два поляризованных световых луча P и S. Затем, луч с P-поляризацией преобразуется при помощи устройства поворота плоскости поляризации в S-поляризованный луч, так как S луч обладает большей эффективностью дифракции, чем Р и достигается значительное увеличение общей эффективности.
Технология высокоэффективного пропускания флуоресценции
Концы флуоресцентных световодов и поверхности детектора покрыты специальным противоотражающим покрытием, чтобы свести все потери сигнала к минимуму, чем достигается высокая степень оптического пропускания.
Точная спектральная информация: три метода коррекции
Три метода коррекции позволяют получить точный спектр: межканальная коррекция чувствительности, которая регулирует смещение и чувствительность каждого канала; коррекция спектральной чувствительности, которая регулирует спектральную эффективность дифракционной решетки и эффективность спектрального детектора; коррекция спектрального пропускания в оптических элементах сканирующих головок и микроскопов.
В случае мультифотонного возбуждения флуоресцентные излучения из глубоких тканей образца сильно рассеиваются, поэтому традиционный детектор, использующий точечную диафрагму, не может обеспечить получение ярких флуоресцентных изображений. Эпископический NDD детектор в A1 MP+/A1R MP+ расположен близко к задней апертуре объектива, что обеспечивает более эффективную регистрацию рассеянного сигнала от глубоких слоев тканей живых организмов. Использование этого четырехканального детектора в сочетании со специальными спектральными зеркалами и алгоритмом спектрального разделения компании Nikon исключает наложение спектров флуоресцентных зондов. При этом исключается фоновая автофлуоресценция, что обеспечивает получение высококонтрастного изображения глубоких слоев образца. При использовании диаскопического NDD детектора вместе с эпископическим NDD детектором можно получить более яркие изображения, благодаря регистрации как отраженных, так и прямых флуоресцентных сигналов.
Новый GaAsP NDD детектор позволяет получать in vivo четкие изображения более глубоких слоев ткани образцов чем прежде и представляет собой достаточно мощное устройство для анализа, например, нейронов мозга живых организмов.
Чувствительность недавно разработанного GaAsP NDD детектора почти в 2 раза превосходит чувствительность стандартного NDD детектора. Это обеспечивает более быстрое формирование изображений и формирование более качественных изображений из Z-стэков. Высокая чувствительность детектора обеспечивает получение флуоресцентных сигналов при меньшей мощности лазера, что позволяет уменьшить наносимый живым клеткам вред.
Быстрое получение мультифотонных изображений in vivo.
Резонансный сканер Nikon способен получать изображения на достаточно высокой скорости (420 кадров/сек) и является самым быстрым мультифотонным микроскопом в мире, использующим технологию точечного сканирования. Уникальным элементом в этом устройстве является зеркало резонансного сканера, способное регистрировать изображения на значительно более высокой скорости по сравнению с традиционными гальванометрическими сканерами. Оптическая система контроля положение резонансного зеркала в режиме реального времени регулирует частоту пикселизации и позволяет получать более стабильные, геометрически правильные и равномерно освещенные изображения даже на высоких скоростях. Это обеспечивает успешную визуализацию быстрых изменений в живых организмах, например, реакции живых организмов, динамику и взаимодействия клеток.
Сканирующая головка A1+/A1R+ высокого разрешения
A1 MP+ оборудован гальвано- (нерезонансным) сканером для получения изображений высокого разрешения.
Гальванический (нерезонансный) сканер A1 MP+ обеспечивает получение изображений с высоким разрешением (до 4096 х 4096 пикселей). Помимо этого, благодаря новейшим системам привода сканера и отбора образцов, а также уникальной технологии коррекции изображений Nikon, также возможно высокоскоростное получение изображений со скоростью 10 к/с (512 х 512 пикселей).
— 1D сканирование: 5200 строк в секунду
— 2D сканирование: 130 к/с (512 х 32 пикселя)
Полнокадровое сканирование: 10 к/с (512 х 512 пикселей)
Высокоскоростная сканирующая головка A1R+
Комбинированная сканирующая головка A1R MP+ снабжена и гальвано-сканером, и резонансным сканером со сверхвысокой резонансной частотой равной 7,8 кГц.
Гальванический (нерезонансный) сканер A1R MP+ обеспечивает получение изображений с высоким разрешением (до 4096 х 4096 пикселей).
Резонансный сканер обеспечивает получение изображений и фотоактивацию со скоростью 420 кадров/сек (512 х 32 пикселей), которая необходима для выявления клеточной динамики и взаимодействия.
— 1D Сканирование: 15 600 строк в секунду (с/с)
— 2D Сканирование: 420 к/с (512 х 32 пикселя)
Полнокадровое сканирование: 30 к/с (512 х 512 пикселей)
Оптический путь в сканирующей головке A1R+:
Резонансный сканер (зеленый оптический путь) используется для получения изображений с высокой скоростью до 420 к/с (с разрешением 512 х 512 пикселей). Во время одновременной фотоактивации и получения изображений резонансный сканер используется для регистрации изображений.
Гальванический сканер (синий оптический путь) используется для получения высококачественных изображений с высоким разрешением до 4096 х 4096 пикселей. Также возможно высокоскоростное получение изображений с частотой кадров до 10 к/с (с разрешением 512 х 512 пикселей). Во время одновременной фотоактивации и получения изображений гальванический сканер используется для фотостимуляции.
Гибридный сканер — это механизм, который позволяет гибко переключаться между двумя сканерами (резонансный и гальванический), либо использовать их одновременно с помощью высокоскоростного гипер-селектора. Может быть введено излучение одновременно от 7 лазеров (максимум 9 длин волн).
Одновременная фотоактивация и получение изображений
Одновременные процессы фотоактивации и получения флуоресцентных изображений проводятся при помощи гальвано-сканера и резонансного сканера. Получение изображений быстрых биологических процессов после фотоактивации возможно благодаря тому, что резонансный сканер способен получать изображения со скоростью 30 кадров/сек.
Стабильное высокоскоростное получение изображений
Для высокоскоростного получения изображения с помощью резонансного сканера используется оригинальная методика определения положения сканирующего зеркала компании Nikon. Постоянные тактовые импульсы генерируются оптическим способом, что обеспечивает отсутствие как эффекта мерцания, так и искажений даже на самой высокой скорости сканирования.
Высокоскоростная передача данных с помощью волоконно-оптической системы
Волоконно-оптическая система передачи данных может транслировать данные с максимальной скоростью 4 Гбит в секунду. Это позволяет передавать изображения (512 х 512 пикселей, 16 бит) в пяти режимах со скоростью 30 кадров в секунду.
Широкое поле обзора
Резонансные сканеры не страдают от перегрева мотора при высокоскоростном получении изображений. Таким образом, отсутствует необходимость в сокращении поля обзора сканированного изображения для предотвращения перегрева. Это обеспечивает большее поле обзора, чем у гальванического сканера
Технические характеристики NIKON A1 MP+:
| Порт ввода-вывода | 2 лазерных порта ввода 3 порта ввода лазерного излучения 4 порта вывода сигнала для 4-х канального PMT-детектора, спектрального детектора, системы VAAS (дополнительной) и детектора стороннего производителя (FCS/FCCS/FLIM) |
|
| Лазер для мультифотонной микроскопии | Совместимый лазер | Mai Tai HP/eHP DeepSee (Newport Corp.) Chameleon Vision II (Coherent Inc.) |
| Модуляция | метод: AOTF (акустооптический настраиваемый фильтр) или AOM (акустооптический модулятор) Метод: Акустооптический модулятор Управление: регулирование мощности, обратная маска, установка экспозиции в изучаемой области |
|
| Оптика для падающего излучения | 700-1080 нм, автоматическая юстировка | |
| Лазер для конфокальной микроскопии (опция) | Совместимый лазер | 405 нм, 440/445 нм, 488 нм, 561/594 нм, 638/640 нм, аргоновый лазер (457 нм, 488 нм, 514 нм), гелий-неоновый лазер (543 нм) |
| Модуляция | метод: AOTF (акустооптический настраиваемый фильтр) или AOM (акустооптический модулятор) управление: контроль мощности каждой длины волны, контроль экспозиции изучаемой области |
|
| Лазерный блок | стандартный: LU4A 4-лазерный блок A или C-LU3EX 3-лазерный блок EX опциональный: C-LU3EX 3-лазерный блок EX (когда в качестве стандартного лазерного блока выбран 4-лазерный блок A) LU-N4, LU-N4S, LU-N3, LU-NV |
|
| Детектор, не требующий десканирования, (NDD) для многофотонной микроскопии | Длина волны | 480-650 нм |
| Детектор | 4 PMT (ФЭУ) | |
| Куб флуоресцентных фильтров | Рекомендуемые наборы фильтров для мультифотонной микроскопии: 492SP, 525/50, 575/25, 629/53, DM458, DM495, DM511, DM560, DM593 | |
| Тип детектора | Эпископический NDD детектор (для Ni-E/FN1/Ti-E) Диаскопический NDD детектор (для Ni-E) Эпископический GaAsP NDD детектор (для FN1) |
|
| Стандартный детектор Флуоресценции (опция) | Длина волны | 400-750 нм (400-650 нм для мультифотонного наблюдения) |
| Детектор | A1-DU4 4 PMT (ФЭУ) A1-DUG 2 GaAsP + 2 PMT (ФЭУ) |
|
| Светофильтр | 6 наборов светофильтров, крепятся в каждое из трех держателей для светофильтров рекомендованные длины волн: 450/50, 482/35, 515/30, 525/50, 540/30, 550/49, 585/65, 595/50, 700/75 | |
| Диаскопический детектор (опция) | Длина волны | 440-645 нм |
| Детектор | PMT (ФЭУ) | |
| Сканирующая головка | Стандартный процесс получения изображения | Сканер: гальванический сканер x2 Размер в пикселях: максимально 4096 x 4096 пикселей Скорость сканирования: Стандартный режим: 2 к/с (512 x 512 пикселей, в оба направления), 24 к/с (512 x 32 пикселя, в оба направления) Быстрый режим: 10 к/с (512 x 512 пикселей, в оба направления), 130 к/с (512 x 32 пикселя, в оба направления)*1 Трансфокатор: 1-1000x бесступенчатый режим сканирования: X-Y, X-T, X-Z, XY вращение, в произвольном направлении |
| Диапазон ИК лазера | 700-1000 нм | |
| Дихроичное зеркало | Метод малого угла падения лучей, позиций: 8 Стандартный фильтр: 405/488, 405/488/561, 405/488/561/638, 400-457/514/IR, 405/488/543/638, BS20/80, IR, 405/488/561/IR |
|
| Спектральный детектор (с гальваническим сканером) (опция) | Количество каналов | 32 канала |
| Диапазон улавливания волн | 400-750 нм (400-650 нм для мультифотонного наблюдения) | |
| Скорость получения спектрального изображения | 4 к/с (256 x 256 пикселей), 1000 линий в секунду Размер в пикселях: максимально 2048 x 2048 пикселей |
|
| Разрешение по длинам волн | 80 нм (2,5 нм), 192 нм (6 нм), 320 нм (10 нм) диапазон длин волн меняется с шагом 0,25 нм | |
| Разделение | Высокоскоростное, точное разделение | |
| Совместимые микроскопы | Инвертированный микроскоп ECLIPSE Ti-E, микроскоп с неподвижным предметным столом ECLIPSE FN1, прямой микроскоп ECLIPSE Ni-E (с фокусирующей револьверной головкой или фокусирующим столом) | |
| Дополнительная комплектация | Система виртуальной адаптируемой диафрагмы VAAS | |
| Программное обеспечение | Воспроизведение/Формирование изображения | 2D-анализ, объемное 3D-изображение, 4D-анализ, спектральное разделение |
| Области применения | FRAP, FLIP, FRET (дополнительно), фотоактивация, получение трехмерных изображений во времени, получение многоточечных изображений во времени, колокализация | |
| Рекомендуемые условия установки | Температура от 20°С до 25°С ± 1°C, круглосуточное кондиционирование воздуха, относительная влажность воздуха 75% или меньше (без образования конденсата), темное помещение или защита микроскопа от света, виброизоляционный стол | |
Технические характеристики NIKON A1R MP+:
| Порт ввода-вывода | 3 порта ввода лазерного излучения 4 порта вывода сигнала для 4-х канального PMT-детектора, спектрального детектора, системы VAAS (дополнительной) и детектора стороннего производителя (FCS/FCCS/FLIM) |
|
| Лазер для мультифотонной микроскопии | Совместимый лазер | Mai Tai HP/eHP DeepSee (Newport Corp.) InSight DeepSee (Newport Corp.) 1300 нм *news Chameleon Vision II (Coherent Inc.) |
| Модуляция | метод: Акустооптический модулятор управление: регулирование мощности, обратная маска, установка экспозиции в изучаемой области |
|
| Оптика для падающего излучения | 700-1080 нм, 700-1300 нм, автоматическая юстировка | |
| Лазер для конфокальной микроскопии (опция) | Совместимый лазер | 405 нм, 440/445 нм, 488 нм, 561/594 нм, 638/640 нм, аргоновый лазер (457 нм, 488 нм, 514 нм), гелий-неоновый лазер (543 нм) |
| Модуляция | метод: AOTF (акустооптический настраиваемый фильтр) или AOM (акустооптический модулятор) управление: контроль мощности каждой длины волны, контроль экспозиции изучаемой области |
|
| Лазерный блок | стандартный: LU4A 4-лазерный блок A или C-LU3EX 3-лазерный блок EX опциональный: C-LU3EX 3-лазерный блок EX (когда в качестве стандартного лазерного блока выбран 4-лазерный блок A) LU-N4, LU-N4S, LU-N3, LU-NV |
|
| Детектор, не требующий десканирования, (NDD) для многофотонной микроскопии | Длина волны | 380-650 нм, 380-750 нм (для 1300 нм) |
| Детектор | A1-DU4 4 PMT (ФЭУ) A1-DUG 2 GaAsP + 2 PMT (ФЭУ) |
|
| Куб флуоресцентных фильтров | Рекомендуемые наборы фильтров для мультифотонной микроскопии: 492SP, 525/50, 575/25, 629/53, DM458, DM495, DM511, DM560, DM593 450/70, 550/80, 610/75, 641/75, 732/68, DM405, DM488/561 | |
| Тип детектора | Эпископический NDD детектор (для Ni-E/FN1/Ti-E) Диаскопический NDD детектор (для Ni-E) Эпископический GaAsP NDD детектор (для FN1) Эпископический GaAsP NDD детектор (для Ni-E/FN1) для 1300 нм |
|
| Стандартный детектор Флуоресценции (опция) | Длина волны | 400-750 нм (400-650 нм для мультифотонного наблюдения) |
| Детектор | 4 PMT (ФЭУ) | |
| ветофильтр | 6 наборов светофильтров, крепятся в каждое из трех держателей для светофильтров рекомендованные длины волн: 450/50, 482/35, 515/30, 525/50, 540/30, 550/49, 585/65, 595/50, 700/75 | |
| Диаскопический детектор (опция) | Длина волны | 440-645 нм |
| Детектор | PMT (ФЭУ) | |
| Сканирующая головка | тандартный процесс получения изображения | Сканер: гальванический сканер x2 Размер в пикселях: максимально 4096 x 4096 пикселей Скорость сканирования: Стандартный режим: 2 к/с (512 x 512 пикселей, в оба направления), 24 к/с (512 x 32 пикселя, в оба направления) Быстрый режим: 10 к/с (512 x 512 пикселей, в оба направления), 130 к/с (512 x 32 пикселя, в оба направления)*1 Трансфокатор: 1-1000x бесступенчатый режим сканирования: X-Y, X-T, X-Z, XY вращение, в произвольном направлении |
| Высокоскоростное получение изображений | Сканер: резонансный сканер (X-ось, резонансная частота 7,8 кГц), гальванический сканер (Y-ось) Размер в пикселях: максимально 512 x 512 пикселей Скорость сканирования: от 30 к/с (512 x 512 пикселей) до 420 к/с (512 x 32 пикселей), 15 600 линий в секунду (линейная скорость) Трансфокатор: 7-ступенчатый (1x, 1.5x, 2x, 3x, 4x, 6x, 8x) Режим сканирования: X-Y, X-T, X-Z Метод получения изображений: стандартное получение изображений, высокоскоростное получение изображений, параллельные фотоактивация и получение изображений |
|
| Диапазон ИК лазера | 700-1080 нм, 700-1300 нм | |
| Дихроичное зеркало | Метод малого угла падения лучей, позиций: 8 Стандартный фильтр: 405/488, 405/488/561, 405/488/561/638, 400-457/514/IR, 405/488/543/638, BS20/80, IR, 405/488/561/IR |
|
| Точечная диафрагма | изменение в пределах 12-256 мкм (плоскость 1 изображения) | |
| Спектральный детектор (с гальваническим сканером) (опция) | Количество каналов | 32 канала |
| Диапазон улавливания волн | 400-750 нм (400-650 нм для мультифотонного наблюдения) | |
| корость получения спектрального изображения | 4 к/с (256 x 256 пикселей), 1000 линий в секунду Размер в пикселях: максимально 2048 x 2048 пикселей |
|
| Разрешение по длинам волн | 80 нм (2,5 нм), 192 нм (6 нм), 320 нм (10 нм) диапазон длин волн меняется с шагом 0,25 нм | |
| Разделение | Высокоскоростное, точное разделение | |
| Совместимые микроскопы | Инвертированный микроскоп ECLIPSE Ti-E, микроскоп с неподвижным предметным столом ECLIPSE FN1, прямой микроскоп ECLIPSE Ni-E (с фокусирующей револьверной головкой или фокусирующим столом) | |
| Дополнительная комплектация | Система виртуальной адаптируемой диафрагмы VAAS | |
| Программное обеспечение | Воспроизведение Формирование изображения | 2D-анализ, объемное 3D-изображение, 4D-анализ, спектральное разделение |
| Области применения | FRAP, FLIP, FRET (дополнительно), фотоактивация, получение трехмерных изображений во времени, получение многоточечных изображений во времени, колокализация | |
| Рекомендуемые условия установки | Температура от 20°С до 25°С ± 1°C, круглосуточное кондиционирование воздуха, относительная влажность воздуха 75% или меньше (без образования конденсата), темное помещение или защита микроскопа от света, виброизоляционный стол | |
